原创《人NSD2基因特异性shRNA慢病毒载体构建与沉默效果评价》
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【摘 要】目的：构建针对人NSD2 基因的shRNA 慢病毒载体,并观察其在人肾293T 细胞中沉默效果,从而为进一步研究NSD2 基因在其他肿瘤细胞系中的表达及影响奠定基础.方法：以NSD2 基因为靶标,设计并合成2 条互补寡核苷酸序列（NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2）克隆至PLKO-puro 重组慢病毒载体中,形成新的重组慢病毒载体PLKO- NSD2-puro.然后与包装质粒PMDL、PV5VG、PREV 在293T 细胞中进行包装, 产生重组慢病毒颗粒, 并进一步感染293T 细胞,通过提取蛋白进行Western Blot 检测NSD2 基因沉默效果.结果：通过PCR 鉴定和DNA 测序鉴定证明NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2 重组shRNA 慢病毒表达质粒中插入了目的DNA 片段.且通过Western Blot 检测NSD2 基因沉默效果,证明了NSD2 shRNA 构建效果不错,可以进一步运用于与NSD2 相关的肿瘤细胞细胞系中.结论：成功构建了人的NSD2 基因shRNA 真核表达的慢病毒载体,为进一步应用于其他与NSD2 相关的癌细胞系,针对NSD2 基因的肿瘤治疗研究奠定基础.
【关键词】NSD2；shRNA；慢病毒；载体构建；293T 细胞
NSD2 又称MMSET(multiple myelomaSET domain) 或者WHSC1(Wolf- Hirschhorn syndrome candidate 1), 位于染色体4p16.3 上,是NSD 蛋白家族的重要成员之一[1].研究发现NSD2 基因的表达水平与多种肿瘤的发生发展密切相关.比如,最初发现的因NSD2 单倍体计量不足导致的以脑部发育过小和智力发育迟缓为特点的沃尔夫综合征（Wolf Hirschhornsyndrome）[2].研究显示NSD2 在多类肿瘤中存在高表达,且与多种肿瘤的发生及恶性程度有关[3],如：淋巴系统肿瘤[4],骨肉瘤[5],乳腺癌,胰腺癌等.且研究显示NSD2 在神经母细胞瘤[6],结肠癌,肺癌等多种肿瘤中存在过表达[1],提示NSD2 有潜在的致瘤作用,表明NSD2 可作为相关肿瘤诊断的理想标志物[1,7].且NSD2 的致癌作用首先在MM（Mutiple Myeloma, 多发性骨髓瘤）中证实的[8],t (4;14)(p16;q32)易位是MM 中最常见的易位之一,与MM的不良预后有直接关系[8,9].多项研究报道,NSD2 的过表达在有t(4;14)(p16;q32) 易位的MM 病例中普遍存在,并成为这种亚型MM的一个关键致癌因素[10].shRNA（shorthairpin RNA ）的发现,已成为特异性抑制基因快捷高效表达的一种技术手段.且近年来慢病毒载体表达的shRNA 介导的基因沉默被广泛应用于基因研究,药物靶点的筛选等.因此为更好的研究NSD2 蛋白在基因区分部特点,以及NSD2 基因与其他基因的相关性,进一步分析NSD2 的转录活性,本研究从shRNA 入手,构建了针对NSD2 基因的shRNA 慢病毒干扰载体,并将该基因的沉默作用侵染到293T 细胞中,并为进一步分析NSD2 基因在其他肿瘤细胞系中的表达机制提供基础.
1 材料和方法
1.1 实验材料
人肾293T 细胞株,TRC2-PLKO-puro慢病毒表达载体质粒, 大肠杆菌DH5a感受态细胞,慢病毒包装质粒PMDL、PV5VG、PREV 全都由中国科学院生物物理研究所李国红研究员实验室馈赠.
1.2 方法
1.2.1 人NSD2 基因靶向shRNA 序列的设计与合成
在NCBI 网Gene 数据库搜索得到人NSD2 基因mRNA 序列(Gene ID: NM-001042424.2-CCDS33940.1) 的转录本,PCR 引物设计按照shRNA 的设计原则,参照人NSD2 基因序列完整的转录本1(NM-001042424.2), 再根据TRC2-PLKO-puro 载体的特点（图1）.酶切位点为Kpn1 与ECOR1, 设计合成2 对shRNA 单链寡核苷酸片段（表1）.将设计的引物发送至上海生工生物有限公司合成,得到干粉 oligoDNA,先用ddH2O 配置成100uM 的溶液.然后引物退火：shRNA#1/2 F/R（100um）各取10ul,5XGC buffer 8ul,ddH2O 12ul共40ul,
沸水（100℃）域煮5min 后,用一个烧杯连同引物加水一块取出,室温下使引物自然冷却,即可形成双链的shDNA.
1.2.2 NSD2-shDNA 片段与PLKO-puro 表达载体的构建
将TRC2-PLKO-puro 载体分别用Kpn1与ECOR1 进行双酶切, 体系为TRC2-PLKO-puro 载体质粒3ug,限制性内切酶Kpn1 与ECOR1 分别1ul,10X buffer 3ul,ddH2O 补足至30ul.然后将NSD2-shDN段与PLKO-puro 表达载体连接.连接体系：T4 酶 0.5ul,载体V（PLKO）0.5ul,10X T4 buffer 2ul,Insert（退火后引物稀释10 倍用）1ul, ddH2O 16ul 共20ul.16℃连接过夜.
1.2.3 重组NSD2-shRNA 干扰表达质粒的鉴定
将连接产物转化至大肠杆菌DH5a.
取80ul 混匀的菌液,均匀涂布于含Amp+100ug/ml 的LB 固体培养基中,37 度培养过夜至长菌.然后随机挑取3 个单克隆菌落,分别接种于4ml 含50ug/ml 的氨苄青霉素LB 液体培养基中,恒温37℃摇床,200rpm/min 震荡摇过夜.次日用生工小提中量质粒提取试剂盒提质粒,并送北京美吉生物测序.测序引物为人的U6通用引物.测序结果与引物序列比对,比对结果（如图2）.
1.2.4 病毒侵染建立稳定细胞系
1.2.4.1 慢病毒包装
（1）当293T 细胞生长密度至细胞基区的65-70% 时, 开始转染细胞.
（2） 取1.77ug shRNA 载体质粒、1.152ugpMDL 质粒、0.62ugpVSVG 质粒和0.469ug pREV 质粒到一个新的1.5ml 无菌EP 管中与DMEM 共250ul 混合均匀,另一管10ul 的biotool 溶液与DMEM 共250ul 混合均匀,室温放置5min 后,将上述的两管溶液在室温下混合均匀,在室温静置20min.全部转移至待转染细胞的细胞培养皿中混匀,将细胞放入培养箱中培养.
（3）转染6-7 小时后, 用新鲜培养基,给已转染的细胞换液并继续培养.
（4）转染48 小时后将含有病毒颗粒的细胞培养基上清液转移至新的15ml 无菌离心管, 再在细胞培养皿中加入3ml 新鲜培养基继续培养.
（5）24h 后再次收取细胞培养基上清,与前次收取的含有病毒颗粒的细胞培养基合并, 室温下2000rpm,离心5min, 用滤器过滤上清液到新无菌管中.
1.2.4.2 用慢病毒侵染细胞
（1）将待侵染的细胞传代至3.5cm 细胞培养皿中,当细胞贴壁时,吸弃细胞培养基.并将病毒悬液滴加在细胞表面,加入0.5ul 10mg/ml polybrene 后混匀,37 ℃恒温箱培养.
（2）侵染8 小时后吸弃细胞培养皿中的液体, 加入2ml 新鲜的细胞培养基继续培养.
（3）在细胞生长为80%,将细胞传代至6cm 细胞培养皿.细胞生长到80% 细胞培养皿时,继续传代.
（4）24 小时后,用加相应抗生素的培养基换液,大约7 天后,存活下来的即为被慢病毒成功侵染的细胞.
1.2.5 Western Blot 检测NSD2 基因沉默是否构建成功.
培养72h 后收细胞.用5 0 0 u l 的R I P I 裂解液（50mMT r i s ； 1 5 0 m M N a c l , 0 . 5 % T r i o nX-100;0.1%DOC,1mMEDTA ）同时加入蛋白酶抑制剂终浓度为（1mM PM,1000Xleupeptin,1000X Aprotinin）水浴超声裂解细胞提取蛋白.加5XSDS loading 终浓度为2X,100℃煮样15min.Western Blot 检测,先将蛋白定量, 10% SDS-PAGE 电泳跑胶,湿转（360mA,90min）转移至NC 膜上.用含5% 脱脂奶粉的TBST 溶液室温封闭1 小时.敷一抗（NSD2 ab75359 1:1000；Tubulin 1:5000）,4℃孵育过夜,用1:10000的HRP 标记的抗鼠二抗室温孵育1 小时.洗膜TBST 洗5 次/7min.化学发光试剂盒显影.
2 结果与分析
2.1 NSD2-shDNA 片段与PLKO-puro 表达载体的构建鉴定
针对NSD2 构建的2 种shRNA-NSD2-PLKO-puro 表达载体经测序验证,结果表明插入的核苷酸序列完全正确无突变碱基（图2）,证实成功构建2 个针对NSD2基因的shRNA 干扰表达载体.将两个质粒分别命名为shRNA-NSD2-PLKO-1 和shRNA-NSD2-PLKO-2.
2.2 Western Blot 检测逆转录病毒转染的人NSD2 基因沉默效果
将shRNA-NSD2-PLKO-1 与shRNANSD2-PLKO-2 干扰质粒通过慢病毒侵染后建立稳定细胞系,以未转染的293T 细胞,以及shRNA-NSD2-PLKO-1 与shRNANSD2-PLKO-2 瞬时转染293T 细胞的样品作为对照组.Western Blot 结果显示瞬时转染的NSD2 表达抑制有所下降,通过慢病毒侵染建立稳定细胞系的NSD2 表达基本全部沉默.图3.
3 讨论
NSD2（MMSET 或WHSC1）是一类组蛋白赖氨酸转移酶, 能催化H3 第36 位发生二化（H3K36me2）[11],在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[5,12].研究表明NSD2 的高表达对基因的影响可能涉及：P53 通路；NF-KB 通路；整合素通路；细胞周期调控机制；c-MYC 的表达等[7,13,14].并且NSD2 与淋巴系统肿瘤等多种肿瘤中都存在表达的异常,与肿瘤的发展及预后密切相关.因此研究NSD2 在基因区的表达水平,对探究肿瘤的特异性靶点以及相关抑制剂的研究具有重要临床意义.
NSD2 作为重要的组蛋白赖氨酸转移酶,在国内研究还比较少.因此为进一步阐明人NSD2 基因的功能及表达,本研究成功构建了2 个人NSD2 基因的shRNA 干扰表达载体shRNA-NSD2-PLKOpuro.通过Western Blot 检测慢病毒侵染的人NSD2 基因沉默效果表明,对照组NSD2 蛋白的表达与shRNA-NSD2-PLKOpuro慢病毒侵染的NSD2 蛋白表达水平有显著差异.表明构建的2 个shRNA 真核表达载体能有效抑制293T 细胞中NSD2 的表达.表明其下调人NSD2 基因表达.其中以慢病毒侵染的shRNA NSD2 沉默效果最佳.总之,本研究成功构建了2 个针对人NSD2 基因的shRNA 干扰表达载体,可显著降低293T 细胞中NSD2 基因的表达,为进一步研究NSD2 基因在其他癌细胞系中的表达及影响机制奠定了基础.
（通讯作者：李艳）
载体论文参考资料：
归纳上述,上述文章是关于沉默和病毒载体和沉默效果评价方面的载体论文题目、论文提纲、载体论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文。
