原创《甘薯茎尖脱毒组培快繁技术》
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甘薯是我国重要的农作物之一,年产量仅次于水稻、小麦和玉米.甘薯以其甘甜可口的特点深得人们的喜爱.此外,甘薯很容易种植,选择水分大、不过于贫瘠的地方插入薯苗即可.因甘薯抗逆性强、用途广等优良品质,在未来很有可能作为一种能源物质用于乙醇的生产.
然而,病毒病却一直影响着甘薯的产量,极大地阻碍了甘薯的生产,中国每年因甘薯病毒病造成的产量损失价值高达40亿元.
当前防治甘薯病毒病的方法通常是剥离茎尖分生组织,离体培养后得到脱毒苗来去除病毒,然后进行培育、快繁,将脱毒种薯应用于大规模的农业生产上.多年来,世界上各个国家的科研人士致力于甘薯脱毒培养技术的研究,以寻求防治甘薯病毒病的最有效的方法,但由于病毒种类多、变异快,很难彻底杜绝甘薯病毒的存在.然而,茎尖分生组织脱毒培养技术为有效防治甘薯病毒病开辟了一片新天地,是目前获取和培养脱毒苗的最常用的手段.经脱毒后的甘薯能恢复其品种原始的优良性状,采用快速繁殖技术将甘薯这些优良品质遗传下去,以达到提高甘薯产量和质量的目的.该研究以商薯19茎尖为外植体,经过愈伤诱导、分化、增殖和生根培养,建立甘薯茎尖脱毒组培快繁技术,为生产优良高质量的甘薯组培脱毒苗提供理论依据.
一、材料与方法
(一)材料
本研究所用的商薯19植株来自郑州师范学院生物工程研究所.
(二)方法
1.无菌芽的获得.选取健康无病斑的商薯块,洗净泥土,用1%高锰酸钾处理15min,0.5%多菌灵浸泡1h后捞出晾干,置于灭菌水中（0.1%的多菌灵）恒温（28℃）催芽,相对湿度80%~85%.薯芽萌发后,于35~40℃（8h/d）下处理30天.当薯芽长至10cm时,用已消毒的解剖刀切下顶部约3cm芽段,剪去已经伸展的叶片,放入烧杯中进行表面消毒,利用3种不同消毒方法（见表1）进行消毒,再用已消毒的纱布吸干芽段外表的水分,置于无菌环境（超净工作台上）.
2.茎尖培养.切取茎尖顶端约1cm长芽段,用已消毒的解剖刀在40倍解剖镜下切除较大的叶原基,用解剖针切下位于茎尖顶端的生长点（生长点为扁平透明的突起）.切下后,用解剖针将茎尖顶端的生长点挑到装有培养基的培养皿中进行茎尖诱导,每个培养皿中接种数量一致（3~4个）.分别用3种培养基进行培养,编号A1、A2、A3,所用培养基及生长状况（见表2）.
3.苗的增殖.茎尖15天后可分化出苗,然后可进行增殖培养.此时,需从培养皿中将苗移植到培养瓶中,此过程应注意保持无菌环境,避免污染,同时注意避免损伤苗的茎和叶.分别用3种不同培养基同时进行培养,编号B4、B5、B6,每个培养瓶中接种的数量一致（3~5个）,所用培养基及增殖状况（见表3）.
4.脱毒苗根的诱导.脱毒苗快速繁殖可利用单茎叶来进行,即在无菌条件下（在超净工作台上进行）,将茎尖苗剪切成小的茎段,每个茎段带1节和1片叶,然后用镊子将单茎叶的形态学下端扦插于培养基中,此过程容易污染,镊子及解剖刀应进行频繁消毒.然后加入生长调节剂来诱导单茎叶生根,侧芽向上生长,得到一棵完整的植株.根的诱导也分为3组同时进行,编号C7、C8、C9,每组所用培养基配比不同,所用培养基及根的诱导情况（见表4）.
5.培养条件.所有培养基均添加蔗糖30g/L、琼脂9g/L,pH值5.8~6.0,120℃灭菌30min,所有的培养温度均为（24&plun;2）℃,光照2500~3000 lx,光照时间为12h/d.
二、结果与分析
(一)不同表面消毒方法对茎尖成活率的影响
由表1可知,外植体以处理A效果最佳,处理B效果次之,处理C效果最差.可见升汞的灭菌效果比次氯酸钠好,从处理A和处理B对比不难得出,0.1%升汞灭菌的时间长短对茎尖成活率也有一定的影响.综合不同灭菌方法的效果来看,最佳选择是处理A.
(二)茎尖诱导
外植体茎段接种15天后观察其生长状况,在加入6-BA和NAA组合的培养基中,无菌芽伸长快,高度正常,并且芽呈绿色（见图1）；在加入KT的培养基中,无菌芽伸长快,植株较高,芽黄绿色,说明KT的加入,茎尖诱导的效果不好；在不加入激素的MS培养基中,无菌芽伸长慢,植株高度不正常,芽黄绿色,说明茎尖诱导需要加入一定量的激素,茎尖诱导的培养基最佳选择为A1号（见表2）.
(三)苗的增殖
茎尖15天后可分化出苗（见图2）,30天后可增殖6~7片叶 (见图3) .从3种培养基的苗增殖情况可看出,6-BA可有效诱导苗的增殖,但较低浓度的效果不佳,6-BA与CW的组合效果最佳；6-BA与NAA的组合不利于叶的生长.综合3种培养基中苗的长势来看,适宜增殖的最佳培养基为B4号,苗生长快、健壮,叶大而绿（见表3）.
(四)生根培养
用已消毒的镊子将单茎叶的形态学下端扦插于培养基中,通过生长调节剂的作用诱导单茎叶生根,侧芽向上生长,形成一棵完整的植株（见图4）.试验表明,NAA有利于单茎叶的诱导生根,浓度稍高的NAA效果更好.综合三种不同培养基中多数幼苗的生根情况来看,诱导生根培养基的最佳选择为C7号,生根多而且健壮,有利于后期整棵植株的营养供应（见表4）.
三、讨论
茎尖分生组织培养技术是当前获取和培养脱毒苗的主要手段.本研究以商薯的茎尖为外植体,初步建立了甘薯的脱毒苗组培快繁体系.由于本试验选取的研究对象是商薯19,因此,本试验所建立脱毒苗快繁体系不一定完全适应其他品种的甘薯.在实践中,可根据事实情况酌情变动培养基的配比.
试验表明：在商薯茎尖表面消毒过程中,通过本试验发现,以0.1%的升汞灭菌6~7min为宜,低于6min外植体容易发生不同程度的污染,高于7min外植体容易死亡,0.1%的升汞灭菌效果好于10%的次氯酸钠.由于升汞对人体及环境有害,使用过的升汞应做特殊处理,不能随意丢弃.
脱毒苗快速繁殖技术的关键在于剥离的茎尖组织的诱导分化,在培养基中加入适量的6-BA和NAA有利于芽的诱导分化,但要注意浓度大小应适中,过高或过低不仅不能诱导分化,反而起抑制作用.
在商薯苗的增殖培养阶段,在培养基中加入适量的CW有利于苗的生长.但是要注意CW的浓度及用量,过高或过低都不能起到促进苗增殖的作用.脱毒苗快速繁殖利用单茎叶来进行,MS培养基和1/2mS培养基是适合商薯生根的基本培养基,在培养基中加入适量的NAA有利于单茎叶的诱导生根,并且生出的根粗壮,有利于后期成苗的营养吸收.
配制培养基时,注意培养瓶封口的工作及培养基灭菌程序,避免污染培养基,影响商薯器官组织的成活率.此外,要注意培养基中添加的蔗糖和琼脂的浓度,以及诱导愈伤组织形成器官时的光照和温度,总之,要尽量给予商薯各组织器官生长的最适条件.
在将茎尖分化出的苗从培养皿移植到培养瓶中时,要注意轻轻夹取,避免用力过度而损伤茎和叶.同时试验要在酒精灯旁操作,避免空气中的细菌污染培养基及茎尖分化组织.此外,操作时动作要快,避免酒精灯热量灼伤茎尖分化组织.
在剥离茎尖组织及切取单茎叶时,多次用到解剖刀、解剖针及镊子,注意每次使用前后都要进行频繁的高温消毒,避免污染商薯茎尖分生组织及单茎叶等,影响脱毒的成功率.此外,经高温消毒的镊子、解剖刀和解剖针要冷却后再使用,避免烫伤商薯幼苗的器官组织,影响成活率.
技术研究论文参考资料：
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