原创《鳄鱼肉多肽的抗氧化性》
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鳄鱼有“活化石”之称,具有寿命最长、免疫力最强、终身不患癌症、骨头最硬的特征.鳄鱼的医药价值远在犀角、虎骨之上,在医学上享有“动物黄金”之美誉,因此国内外对其研究日益加深[1-2].目前.已有许多学者利用生物酶解技术以沙丁鱼、油菜籽、鲢鱼等多种原料制备了许多抗氧化活性多肽[3-5].据研究报道,鳄鱼肉中含人体8 种必需氨基酸,是优势的蛋白资源[6].除此之外,抗氧化肽是目前国内外研究较多的一种生物活性肽,安全、稳定、高效[7-8].目前国内外对鳄鱼的研究主要侧重于养殖方面,在对鳄鱼肉多肽抗氧化性研究方面还没有系统性的报道.Zhong[9] 只是研究报道相对分子质量＜ 1 000 组分的自由基清除能力较强.
本研究采用0.8% 碱性蛋白酶对鳄鱼肉进行酶解,通过减少相对分子质量的大小,进行抗氧化活性研究,探讨鳄鱼肽的生物活性变化,为功能性鳄鱼肉蛋白产物的开发利用提供一定理论基础和应用基础.
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
鳄鱼肉由北京百生康提供,于-18 ℃冷冻保存；1,1- 二-2- 苦基腙肼（DPPH）,购于Sigma 公司,分析级；硫酸亚铁、三氯乙酸、无水乙醇、浓硝酸、磷酸缓冲液、双氧水、邻非罗啉、三氯化铁,购于中国国药,分析级；甲醇、乙腈、氨基酸标准品购于中国国药,色谱级；碱性蛋白酶 购于诺维信,食品级.高效液相色谱仪LC-20AT,C18column （250 mm×4.6 mm）, 日本岛津； 紫外分光光度仪mini-1240（Shimadzu 公司）；生化培养箱SPX-250B-Z（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）.
1.2 实验方法
1.2.1 鳄鱼肉浆液制备
将鳄鱼肉洗净后,准确称重,切小块加入2 倍水,放入均质机中匀浆.
1.2.2 鳄鱼多肽液制备
向鳄鱼肉浆液中加入鳄鱼肉质量0.8% 的碱性蛋白酶,持续酶解6 h.酶解条件为60 ℃、pH 9.0（加NaHCO3 调节pH）.每隔0.5 h 取样,高温灭酶,过滤,得到不同酶解时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h和4.5 h）的酶解鳄鱼多肽液.
1.2.3 鳄鱼脱色多肽液制备
将鳄鱼多肽液准确量取体积V,加入鳄鱼多肽液质量2% 的活性炭,在50 ℃条件下脱色2 h.
1.2.4 相对分子质量测定
酶解物相对分子质量分布的测定采用凝胶层析法[10-11],由Sephadex G-15 柱(φ1.1 cm×50 cm) 分析检测.
1.2.5 抗氧化性测定
1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力测定
利用DPPH 醇溶液呈紫色并在517 nm 处有强吸收的特点定量测定鳄鱼多肽制备过程中,DPPH 清除能力的变化.将1 mg 的DPPH 溶于无水乙醇,定容至10 mL,配制成0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液,避光保存.取1 mL 固形物含量为2% 的样品溶液（鳄鱼肉浆、鳄鱼酶解液和鳄鱼脱色液）和4 mL 的DPPH 醇溶液于棕色带塞试管中,均匀震荡,在室温下避光反应30 min 后立即在517 nm 处测定其吸光值As.再取1 mL固形物含量为2%样品溶液和4 mL无水乙醇溶液,均匀混合在相同条件下反应,测定吸光值A0.取1 mL蒸馏水和4 mL 的DPPH 醇溶液均匀混合在相同条件下反应,测定吸光值Ac.按照公式（1）计算鳄鱼酶解不同时间条件下的抗氧化性变化.
DPPH 清除率(%)等于（As-A0）/Ac×100% （1）
式（1）中,A0 为空白组吸光值；Ac 为对照组吸光值；As 为样品测定值.
1.2.5.2 羟基自由基（OH）清除能力测定利用Fenton 反应将1.0 mL 的7.5 mmol/L 邻菲罗啉与2.0 mL pH 7.4 的磷酸盐缓冲液,1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亚铁溶液充分混匀.再加入0.1% H2O2 溶液,加入1 mL 的质量浓度2% 的样品溶液震荡均匀后置于37 ℃水浴中反应60 min,在536 nm 处测定其吸光度As.再用1 mL 的蒸馏水代替样品做空白对照A0.用1 mL 蒸馏水代替H2O2,1 mL 蒸馏水代替样品,测定吸光值Ac.
羟基自由基（OH）清除率(%)等于（As-A0）/Ac×100%
（2）
式（2）中,A0 为空白组吸光值；Ac 为对照组吸光值；As 为样品测定值.
1.2.5.3 超氧阴离子自由基清除能力测定反应显色体系：4.5 mL pH 为8.34 的磷酸缓冲液,1.2 mL 蒸馏水在25 ℃ 下保温30 min, 加入0.3 mL25℃的邻苯三酚,4 min 后立即在325 nm 下测定吸光值Az.另将0.5 mL 样品、0.7 mL 蒸馏水、4.5 mL 的磷酸缓冲液在25 ℃下保温30 min,加入0.3 mL 25 ℃的邻苯三酚,在4 min 后立即在325 nm 下测定吸光值As.
超氧阴离子自由基清除能力(%)等于（Az-As）/Az×100%
（3）
式（3）中,Az 为4 min 内邻苯三酚的自氧化吸光值；As 样品氧化后吸光值.
2 结果与讨论
2.1 DPPH 自由基清除能力
经测定, 鳄鱼肉浆清除自由基DPPH 能力为48.68%,低于部分鳄鱼肽.如图1 所示,不同酶解程度的鳄鱼肽相对分子质量不同,氨基酸的组成不同清除自由基DPPH 能力不同.随着酶解程度的不断加深,鳄鱼蛋白不断被水解成多肽、氨基酸疏水基不断暴露,相对分子质量变小.
在碱性蛋白酶酶解2 h 时,鳄鱼肽分子量为2 200时, 鳄鱼肽清除自由基DPPH 的能力最强, 达到85.4%,远远高于鳄鱼肉浆清除自由基能力46.68%.说明酶解蛋白成小分子肽有利于对自由基DPPH 清除能力的提高,有助于鳄鱼功效性提升.但继续酶解鳄鱼蛋白,鳄鱼蛋白继续水解成更小分子,其清除自由基DPPH 能力降低.这一趋势说明鳄鱼肽在一定分子量范围内,多肽链具有较强的清除自由基DPPH 能力.
2.2 羟基自由基（OH）清除能力
如图2 所示,酶解时间越长,鳄鱼肉多肽液中的相对分子质量逐渐减小,其羟基自由基清除能力逐渐增加到平稳趋势,考虑到鳄鱼肉多肽液的活性,发现酶解时间在2 h 时,在相对分子质量为2 200 时,羟基自由基的清除能力高达83.479%,与其DPPH 自由基清除能力相呼应,说明相对分子质量过低,酶解时间过长,其鳄鱼肉多肽液的生物活性反而不是最高.
2.3 超氧阴离子自由基清除能力
如图3 所示,酶解时间越长,鳄鱼肉多肽液相对分子质量逐渐减小,其超氧阴离子自由基清除能力逐渐增加,考虑到鳄鱼肉多肽液的活性,发现酶解时间在2 h 时,在相对分子质量为2 200 时,超氧阴离子自由基的清除能力高达75.976%,但是都低于DPPH 和OH自由基的清除能力,高于其他鱼肉自由基清除能力,与其DPPH 自由基、羟基自由基清除能力相呼应,说明相对分子质量过低,酶解时间过长,其鳄鱼肉多肽液的生物活性反而不是最高.
3 结论
经过碱性蛋白酶酶解后的鳄鱼肉多肽液对DPPH、OH 和超氧阴离子自由基的清除能力不同,且酶解时间对其影响也是不同程度的变化的,而酶解时间过长会导致相对分子质量的大大减小,导致多肽含量过高,生物活性降低明显.当酶解时间为2 h 时,相对分子质量为2 200 时,鳄鱼肉多肽液对DPPH、OH 和超氧阴离子自由基的清除能力分别是85.4%、83.479%、75.976%,表现出较好的抗氧化性,具备作为天然抗氧化剂的潜力.
抗氧化论文参考资料：
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