原创《电化学发光法高灵敏检测左氧氟沙星》
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左氧氟沙星[1（] LVFX）系第三代喹诺酮类抗生素,对细菌、支原体及部分厌氧菌有效,广泛应用于临床系统感染,服用不当或长期使用,会出现过敏反应、中枢神经反应等不良反应,致病菌易产生耐药性,因此检测左氧氟沙星具有重要意义.目前测定左氧氟沙星的方法有紫外光谱法[2-3]、荧光光谱法[4-5]、高效液相色谱法[6-7]、毛细管电泳法[8]、电化学发光分析法[9]以及化学发光法[10]等,但这些方法存在操作复杂、灵敏度较低、动态范围窄、操作繁琐等缺点.因此,建立一种检测左氧氟沙星的新方法十分必要.电化学发光（ECL）技术具有高灵敏度、宽动态范围、易操作、可控的电位性等优点[11].联吡啶钌/Nafion/ AuNPs (Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs)复合膜在电化学发光分析技术的应用研究中在很短时间内得到了迅速发展.原因在于Nafion是一种离子交换型聚合物,具有很高的抗化学侵蚀性质和成膜性质, 金纳米粒子良好的导电性和较大的比表面积[12],这样Nafion/AuNPs 复合物就能够稳定有效的固定Ru (bpy)32+, 从而有效确保Ru(bpy)32+电化学发光的超强稳定性,提高了分析检测效率.本文利用Nafion/ AuNPs 复合膜包埋稳定Ru(bpy)32+的固定技术,实现了Ru(bpy)32+高效稳定的固定, 成功组装在修饰电极表面,制备出Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE修饰电极,利用该修饰电极对左氧氟沙星的电化学发光性能进行研究.
1.1 仪器与试剂
左氧氟沙星注射液（0.2 g,100 mL,石家庄四药有限公司）,左氧氟沙星结构式见图1.钌联吡啶化合物Ru(bpy)32+,Nafion（全氟代磺酸脂）,氯金酸和柠檬酸钠购自Sigma 公司； 三丙正胺（Tri-n-propylamine,简称TPrA）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、铁、亚铁均购自国药集团化学试剂有限公司.磷酸盐缓冲溶液（PBS）,用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制；其它所用化学试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.
透射电子显微镜（TEM）（JEOL,JEM-2100,日本）；电化学发光检测全程使用MPI-E 型电化学发光仪（西安瑞迈电子公司）.电化学发光采用传统的三电极系统,工作电极是玻碳电极（直径2.0 mm）及修饰电极,参比电极为装有饱和KCl溶液的Ag/AgCl电极,对电极是铂片电极.-600 V设为检测时光电倍增管（PMT）的高压.电化学测量过程使用CHI 660D 电化学工作站（上海辰华仪器公司）.pHS-25型pH 计购于上海雷磁仪器厂；KQ-100B 型超声波清洗器购于昆山超声仪器有限公司.
1.2 裸电极预处理
直径2 mm 的玻碳电极用粒径为0.3 μm 和0.05 μm 的Al2O3泥浆中打磨抛光, 然后依次用体积比1:1 的硝酸、无水乙醇和二次蒸馏水超声清洗2 min,最后用氮气吹干备用.
1.3 金纳米粒子的制备
根据文献[12]利用柠檬酸盐还原法制备金纳米粒子.先将氯金酸配制成0.01%的溶液,取50 mL氯金酸溶液加热至沸腾后再往里面加入1%的柠檬酸三钠溶液5.6 mL,当看到淡的氯金酸水溶液经灰色、黑色、紫色的颜色变化,最终变为红色时,继续加热和搅拌12 min 后,停止加热,然后继续搅拌溶液15 min后至溶液呈室温.最后,将该溶液转入棕色试剂瓶中于4 ℃保存备用.
1.4 AuNPs/Nafion/GCE 修饰电极的制备将制备好的纳米金分散于Nafion中,于高速混合仪上混合20 min, 制得Nafion/AuNPs 悬浮液.取10 μL AuNPs/Nafion 混合后的悬浮液均匀滴到预先处理干净的玻碳电极表面,在空气中自然晾干, 待电极表面形成一层均匀的薄膜后,即得AuNPs/Nafion/GCE 修饰电极.
1.5 电化学发光传感器的制备
滴加AuNPs/Nafion 悬浮液到预先处理好的玻碳电极表面, 自然晾干后再滴加10 μLRu(bpy)32+得到Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs 修饰的玻碳电极, 将该传感器避光保存于4 ℃环境下备用.用0.01 mol·L-1 pH 等于 7.4 的PBS 溶液冲洗电极,除去电极表面多余的Ru(bpy)32+,最终可制得修饰电极Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE,即得电化学发光传感器.
2 结果与讨论
2.1 金纳米粒子表征
金纳米粒子的透射电镜分析谱图见图2.从图2中可以看出,制备纳米粒子粒径为纳米级的,表面较光滑,形状为圆球状,粒径大约为10 nm.
2.2 实验方法的可行性
在预先处理好的玻碳电极上滴加5.0 μL0.5 mg·mL-1的Nafion/AuNPs 悬浮液,室温晾干,再滴加5.0 μL 1.0 ×10-5 mol·L-1 的Ru (bpy)32+溶液,室温晾干备用,形成Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE 修饰电极, 即为电化学发光传感器.由于Nafion 具有良好的成膜效应,Nafion 带负电和三联吡啶钌带正电, 二者由于静电作用相互吸引,使三联吡啶钌能够稳定的固定在电化学发光传感界面上.为了证明该实验方法的可行性,采用电化学发光技术进行研究.对比了修饰的玻碳电极上存在目标物左氧氟沙星和不存在目标物左氧氟沙星的电化学发光强度.图3 为修饰电极与不同浓度的左氧氟沙星反应后检测的电化学发光强度.曲线a为不存在左氧氟沙星时,电化学发光强度非常低.曲线b为1.0×10-11 mol·L-1的左氧氟沙星与修饰电极结合后的电化学发光强度,电化学发光强度增强.当左氧氟沙星浓度继续升高为5.0×10-10 mol·L-1时, 电化学发光强度也显著增强（如曲线c 所示）.这表明随着溶液中左氧氟沙星的浓度增加电极的电化学发光强度显著增强.
因此,修饰电极Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE 可用于检测左氧氟沙星.
2.3 杂交时间优化
本文对关键实验参数杂交时间进行了优化,以获得所制电化学发光传感器优良性能.图4为Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE 修饰电极与目标物1.0×10-11 mol·L-1左氧氟沙星的杂交时间与电化学发光积分值的变化关系图,从图4 中可以看出在30 min 之前电化学发光强度值随杂交时间的增加急剧增加.到60 min 后电化学发光强度趋于稳定,为确保Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE 和目标物充分杂交,70 min被选为杂交时间.
2.4 检测范围和灵敏度
图5 为相同的修饰电极在不同浓度左氧氟沙星与其对应的电化学发光强度,图5 分析研究了电化学发光传感器与不同浓度左氧氟沙星相互作用, 在此实验条件下对左氧氟沙星进行了定量检测.由图5可以可知,当左氧氟沙星的浓度不断增大时,电化学发光强度也越强,同时也可以验证出左氧氟沙星对联吡啶钌Ru(bpy)32+的电化学发光信号有较强的增敏作用.图6为不同浓度的左氧氟沙星与其在修饰电极上电化学发光强度的校准曲线,结果表明,随着左氧氟沙星溶液浓度的不断增大, 电化学发光强度值也不断增大.
以三次平行测量左氧氟沙星所得电化学发光强度的平均值对左氧氟沙星浓度的对数作图在5.0×10-12～1.0×10-9 mol·L-1的浓度范围内,电化学发光的强度与其左氧氟沙星的浓度呈良好的线性关系, 线性方程为I 等于1.634×106 + 1.36×105 logC,线性相关系数R等于0.994 3,检出限(S/N等于3)为3.0×10-12 mol·L-1.结果表明, 相对于电化学发光法[9]和化学发光法[10]具有较高的灵敏度和较低的检出限.而且无需加入杂交指示剂,使操作程序大大简化.
2.5 传感器的重现性和贮存稳定性
通过研究5 支按相同方法制备的修饰电极与同一浓度（1.0×10-10 mol·L-1）的左氧氟沙星杂交前后电化学发光强度的变化值来考察传感器的重现性,5支电极测定结果的RSD 为5.2%.结果表明,该电化学发光传感器测定左氧氟沙星有良好的重现性.构制的传感器不用时4 ℃下于PBS中避光保存.在15 d 后, 考察修饰电极Ru(bpy)32+/Nafion/AuNPs/GCE传感器对1.0×10-10 mol·L-1的左氧氟沙星的响应情况,结果显示,电化学发光信号强度值保持稳定,该稳定性实验说明所构建的传感器具有良好的贮存稳定性.
3 结论
本文以三联吡啶钌为信号物质,以左氧氟沙星为目标检测物质,以金纳米粒子作为放大信号物质,构制了一种高灵敏测定药物的电化学发光传感器.因为金纳米粒子良好的导电性和较大的比表面积,导致电化学发光信号联吡啶钌的具有增大的氧化还原电流,所以导致电化学发光信号也有很大增强.该传感器具有制作简单,检测速度快等优点,从而为DNA 杂交传感器的设计、以及药物的检测提供了有益借鉴.
电化学论文参考资料：
回顾述说，这篇文章为一篇适合不知如何写左氧氟沙星和电化学和灵敏方面的电化学专业大学硕士和本科毕业论文以及关于电化学论文开题报告范文和相关职称论文写作参考文献资料。
